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OECD231:内分泌撹乱物質スクリーニングプログラム - 両生類変態アッセイ

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内分泌攪乱物質は、内分泌系の機能を変化させ、結果として正常な生体、その子孫、母集団(亜集団)の健康に有害な影響を及ぼす外因性物質または混合物です。

執筆者:

Sarah Broadley - 理学士(優等学位)、理学修士、教員資格、研究科学者 Ⅳ、特殊病理学サービス;Catherine Ross 医師 - 獣医学博士、理学修士、王立獣医師協会会員、病理学者、Covance Laboratories Ltd., Harrogate, UK 病理学部門 病理学者

日付:

2021年1月

はじめに

「内分泌攪乱物質(ED)、内分泌系の機能を変化させ、結果として正常な生体、その子孫、母集団(亜集団)の健康に有害な影響を及ぼす外因性物質または混合物です。」世界保健機関(WHO) - 2002年度 国際科学物資安全計画(ICPS)。

環境化学物質が人体および自然界に有害な影響を及ぼすとの懸念から、経済協力開発機構(OECD)は潜在的な内分泌攪乱物質のスクリーニングと試験を行うためのガイドラインの訂正ならびに開発に着手することを優先活動事項に盛り込みました。この試験には、げっ歯類での 28 日間の反復投与試験(試験ガイドライン 407)と、両生類変態アッセイ(AMA 試験ガイドライン 231)の強化が含まれます。

「内分泌攪乱物質(ED)、内分泌系の機能を変化させ、結果として正常な生体、その子孫、母集団(亜集団)の健康に有害な影響を及ぼす外因性物質または混合物です。」世界保健機関(WHO) - 2002年度 国際科学物資安全計画(ICPS)。

環境化学物質が人体および自然界に有害な影響を及ぼすとの懸念から、経済協力開発機構(OECD)は潜在的な内分泌攪乱物質のスクリーニングと試験を行うためのガイドラインの訂正ならびに開発に着手することを優先活動事項に盛り込みました。この試験には、げっ歯類での 28 日間の反復投与試験(試験ガイドライン 407)と、両生類変態アッセイ(AMA 試験ガイドライン 231)の強化が含まれます。

規制

2018年に OECD は、内分泌攪乱化学物質の試験と評価のための概念的枠組みを修正して発表しました。この概念的枠組みは 5 段階の試験から成り、ツールボックスとしての利用を想定しています。

レベル 1 - 既存の情報に基づく仕分けと優先順位付け

レベル 2 - 機構的なデータを提供する In vitro アッセイ

レベル 3 - 選択済みの内分泌機構と効果に関するデータを提供する In vivo アッセイ。

レベル 4 - 内分泌機構への有害な効果に関するデータを提供する In vivo アッセイ

レベル 5 - 内分泌および他の機構の包括的なデータを提供する In vivo アッセイ

両生類変態アッセイは、魚類短期繁殖アッセイ、向子宮性アッセイ、Hershbergers アッセイとともにレベル 3 に分類されます。

欧州では現在、内分泌撹乱に関して要請がない限り特定の試験を使用する法令要件は存在しません。

しかし米国では試験が必須要項となっており、米国環境保護庁(EPA)が策定した 2 段階の戦略があります。

ティア 1 アッセイ - In vitro および In Vitro アッセイの選択。両生類変態アッセイおよび魚類短期繁殖アッセイは、この試験領域に含まれます。

ティア 2 アッセイ - 哺乳類第 2 世代の毒性、両生類の成長/繁殖、鳥類第 2 世代、魚類第 2 世代、アミ科の第 2 世代を含む In vivo 頂端アッセイ。

両生類変態アッセイ

試験材料および試験法

両生類変態アッセイ(AMA)は、経験に基づいて視床下部下垂体(HPT)軸の機能に障害を及ぼす可能性のある物質を識別することを目的とした、スクリーニング アッセイです。これは HPT 軸内で活性的な物質に反応する、よく研究された甲状依存のプロセスを提供し、同時に形態発達途上の動物の甲状活動を検出する、唯一の既存アッセイでもあります。

このテストデザインでは、ステージ 51 のアフリカツメガエルのオタマジャクシを、最低 3 種類の試験化学物質にさらし、治水状態で 21 日置きます。オタマジャクシの幼生密度は 1 タンクにつき 20 匹です。

7 日目の測定

ランダムに5匹のオタマジャクシが選ばれ、人道的に安楽死させられます。その後洗浄され、水分を拭き取られてから、体重が計測されます。一匹一匹のオタマジャクシについて、後肢、吻端から総排出口の長さ、発達段階が確定されます。

21 日目の測定

残ったオタマジャクシは試験タンクから取り出され、人道的に安楽死させられました。その後洗浄され、水分を拭き取られてから、体重が計測されます。一匹一匹のオタマジャクシについて、後肢、吻端から総排出口の長さ、発達段階が確定されます。

オタマジャクシは、全身サンプル、または下顎を含む頭部を切除したサンプルとしてデビットソン固定液に 48~72 時間浸されます。

各タンクより5匹のオタマジャクシには組織病理評価が行われます。

組織診の準備

組織切除 - 頭部全体がパラフィンワックスで処理されます。

埋め込み - 頭部は腹側から背側に向けて水平に(縦方向 - LS)に配置、または断面部位を下向き(横方向 - TS)に配置します。

ミクロトーム法 - 5 段階の切片が甲状腺から切除され、ヘマトキシリンとエオシンで染色されます。

組織病理学

診断基準に含まれるもの:甲状腺肥大/萎縮 濾胞細胞肥大 濾胞細胞肥厚化

濾胞腔エリア/コロイド品質および濾胞細胞の高さ/形状

図 1。甲状腺(矢印)、縦断面、x2 倍率。


図 2。甲状腺(矢印)、x10 倍率。Bar = 50µm。


図 3。甲状腺(矢印)、横断面、x2 倍率。


図 4。甲状腺(矢印)、横断面、x10 倍率。Bar = 100µm。

結果

甲状腺組織構造への影響が発達への影響なしに認められました。組織病理的な変化が甲状部に見られる場合、活性状態と判断されます。発達遅延や組織病理的な変化が見受けられない場合、化学物質は甲状非活性と判断されます。これは甲状腺が甲状腺刺激ホルモン(TSH)の影響を受けていて、それが甲状腺ホルモンの循環を妨害しTSHの分泌を変化させると、組織病理的変化が甲状腺に起きるためです。

参照

OECD (2018年)、改訂版指導文書 -150 - 内分泌撹乱に関して化学物質を評価する際の統一テストガイドライン、OECD 一連のテストおよび評価、OECD 出版社(パリ)。https://doi.org/10.1787/9789264304741-en

OECD(2009年)、テスト No.231:両生類変態アッセイ、OECD 化学物質のテストガイドライン、セクション2、OECD 出版社(パリ)、https://doi.org/10.1787/9789264076242-en。

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