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OECD229:内分泌撹乱物質スクリーニングプログラム - 魚類短期生殖アッセイ

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内分泌攪乱物質は、内分泌系の機能を変化させ、結果として正常な生体、その子孫、母集団(亜集団)の健康に有害な影響を及ぼす外因性物質または混合物です。

執筆者:

Sarah Broadley - 理学士(優等学位)、理学修士、教員資格、研究科学者 Ⅳ、特殊病理学サービス;Catherine Ross 医師 - 獣医学博士、理学修士、王立獣医師協会会員、病理学者、Covance Laboratories Ltd., Harrogate, UK 病理学部門 病理学者

日付:

2021年1月

はじめに

「内分泌攪乱物質(ED)、内分泌系の機能を変化させ、結果として正常な生体、その子孫、母集団(亜集団)の健康に有害な影響を及ぼす外因性物質または混合物です。」世界保健機関(WHO) - 2002年度 国際科学物資安全計画(ICPS)。

内分泌撹乱物質スクリーニングプログラム(EDSP)は、農薬や化学物質などが、内分泌系の撹乱により人の健康や環境に影響を及ぼす恐れがあるかどうかを判断することを目的としています。短期生殖アッセイ(試験ガイドライン 229)は、ファットヘッドミノー(ピメファレス プロメラス)を用いて検証されており、エンドポイントのサブセットは日本のメダカとゼブラフィッシュでも検証されています。このアッセイでは、視床下部-下垂体-性腺(HPG)の内分泌軸の撹乱にまつわる影響を示す一連の組織学的および生化学的エンドポイントを用いて、生殖能力への毒物の影響の総合的な尺度としています。

規制

2018年に OECD は、内分泌攪乱化学物質の試験と評価のための概念的枠組みを修正して発表しました。この概念的枠組みは 5 段階の試験から成り、ツールボックスとしての利用を想定しています。

レベル 1 - 既存の情報に基づく仕分けと優先順位付け

レベル 2 - 機構的なデータを提供する In vitro アッセイ

レベル 3 - 選択済みの内分泌機構と効果に関するデータを提供する In vivo アッセイ。

レベル 4 - 内分泌機構への有害な効果に関するデータを提供する In vivo アッセイ

レベル 5 - 内分泌および他の機構の包括的なデータを提供する In vivo アッセイ

魚類短期生殖アッセイは、両生類変態アッセイ、向子宮性アッセイ、ハーシュバーガーアッセイとともにレベル 3 に該当します。

欧州では現在、内分泌撹乱に関して要請がない限り特定の試験を使用する法令要件は存在しません。

しかし米国では試験が必須要項となっており、米国環境保護庁(EPA)が策定した 2 段階の戦略があります。

ティア 1 アッセイ - In vitro および In Vitro アッセイの選択。魚類短期生殖アッセイと両生類変態アッセイがこの試験範囲に入ります。

ティア 2 アッセイ - 哺乳類第 2 世代の毒性、両生類の成長/繁殖、鳥類第 2 世代、魚類第 2 世代、アミ科の第 2 世代を含む In vivo 頂端アッセイ。

魚類短期生殖アッセイ

試験材料および試験法

この試験では、3 つのテスト濃度と対照群が必要です。

ゼブラフィッシュの場合、1 つの処理につき容器 2 つ(各容器には 5 匹のオスと 5 匹のメスを含める)。

ファットヘッドミノーの場合、1 つの処理につき容器 4 つ(各容器には、ファットヘッドミノーのオスの縄張り行動のため、2 匹のオスと 4 匹のメスを含める)。

日本のメダカは、1 つの処理につき 4 つの容器またはレプリケート(各容器には 3 匹のオスと 3 匹のメスを含める)。

以下のパラメータが評価されます。

分析化学 - 週に一度、水槽から水のサンプルを採取し、テスト化学物質のレベルを分析します。

ビテロゲニン(Vg) - ELISA 法により、卵黄前駆体タンパク質の量を測定します。Vg は通常、メスの魚でのみ発現し、オスでは不活発です。しかし、オスの魚が内分泌撹乱物質にさらされると、Vg 遺伝子が用量依存的に発現します。そのため、オスの魚における Vg 遺伝子の発現は、エストロゲン系内分泌攪乱物質への暴露マーカーとして用いられています。

形態学的観察 - オスの体色、脂肪体(終了時の存在と重量)、繁殖結節のマッピング、対照群と比較した生存率と行動の毎日の評価など、二次性徴の出現を観察します。

受精の成功を評価し、胚を目視確認し、不妊卵と受精卵を数えます。

繁殖力 - 一日の卵生産量を評価します。

生存率、行動、外観 - 魚を毎日観察し、対照群と比較して死亡率と異常行動がないかを調べます。

二次性徴の観察 - 二次的な特殊性徴も観察されます。たとえば、ファットヘッドミノーのオスの繁殖結節や、日本のメダカの乳頭状小突起などがあります。

図1. ファットヘッドミノーのオスの繁殖結節を示す図 場所テンプレートを使って、結節の数と大きさを記録し、次のようにランク付けします。0 - 無し、1 - あり、2 - 肥大、3 - 顕著。

OECD(2012年)、テスト No.229:魚類短期生殖アッセイ、OECD 化学物質のテストガイドライン、セクション 2、OECD 出版社(パリ)、https://doi.org/10.1787/9789264185265-en。

組織診の準備

組織のトリミング / 処理

ファットヘッドミノー - 生殖巣を魚から切除し、全体をパラフィンワックスで処理されます。

メダカとゼブラフィッシュ - 必要に応じて魚の体をトリミングし、胴体全体をパラフィンワックスで処理します。

埋め込み- 生殖腺 / 魚は長軸に対して水平方向に配置します。

ミクロトーム法 - 生殖器の中心部から 3 段階の切片が切除され、ヘマトキシリンとエオシンで染色されます。

組織病理学

オス - 一次診断基準:精原細胞の割合の増加、精巣卵の存在

精巣変性の増加

間質(ライディッヒ)細胞の過形成 / 肥大

オス - 二次診断基準:

精原細胞の割合の減少

血管または間質のタンパク液の増加、生殖腺の非同時性の発達

精原細胞または精子細胞の割合の変化、生殖腺ステージング

肉芽腫性炎症

図1. ファットヘッドミノーのオスの生殖腺、20 倍拡大。Bar = 50µm。


ファットヘッドミノーのオスの生殖腺、40 倍拡大。

図2. ファットヘッドミノーのオスの生殖腺、40 倍拡大。Bar = 20µm。小葉の周辺で発達する精子の全ステージに注目。(1)1˚ 精母細胞、(2)2˚ 精母細胞、(3)1˚ 精母細胞、(4)2˚ 精母細胞、(5) 精子細胞。

組織病理学

メス - 一次診断基準:

卵子無形成の増加

毛包周囲細胞の過形成 / 肥大、卵黄形成の減少

生殖腺ステージングの変化

メス - 二次診断基準:

間質性線維症

卵管内の卵の組織片、肉芽腫性炎症、排卵後の卵胞の減少

ファットヘッドミノーのメスの生殖腺、4 倍拡大。

図3. ファットヘッドミノーのメスの生殖腺、4倍拡大。Bar = 200µm。両図とも、卵子の発達段階を示す。(1) 核周囲の卵母細胞、(2) 皮質肺胞の卵母細胞、(3) 初期卵胞形成卵母細胞、(4) 後期卵胞形成卵母細胞。


ファットヘッドミノーのメスの生殖腺、40 倍拡大。

図4. ファットヘッドミノーのメスの生殖腺、40倍拡大。Bar = 20µm。

結果

魚類短期生殖アッセイは、内分泌活性の可能性を示すことを目的としたスクリーニング試験であり、特定のメカニズムや作用機序、悪影響を確認するものではありません。したがって、1 つ以上のアッセイ項目で統計的に有意な効果があれば、被験物質が魚類のHPG軸を乱す可能性を示していると考えられます。

参照

OECD (2018年)、改訂版指導文書 -150 - 内分泌撹乱に関して化学物質を評価する際の統一テストガイドライン、OECD 一連のテストおよび評価、OECD 出版社(パリ)。https://doi.org/10.1787/9789264304741-en

OECD(2012年)、テスト No.229:魚類短期生殖アッセイ、OECD 化学物質のテストガイドライン、セクション 2、OECD 出版社(パリ)、https://doi.org/10.1787/9789264185265-en。

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