リンフローサイトメトリーを用いた固形腫瘍のリン酸化タンパク質の検知

この記事では、リンフローサイトメトリーを用いて固形腫瘍のリンタンパク質を検出する方法を紹介します。また、カボザンチニブが誘発する、腫瘍内の PI3K/AKT および JAK-STAT シグナル阻害と、宿主免疫細胞の比較分析を論評します。

The in vivo efficacy of small molecule inhibitors is often assessed by measuring the phosphorylation state of cell signaling proteins within the pathways the drug targets. これは、固形腫瘍の分析が必要な場合は難しくなりがちです。げっ歯類のモデルを使う前臨床研究では、腫瘍分析の最も一般的なアプローチは免疫ブロット法と ELISA ベースの手法です。ただし、こうしたバルク分析法には 2 つの大きな短所があります。複数の標的を同時に計測するその相対的な能力は不十分です。より重要なのは、異種の腫瘍サンプルにある複数の異なるサブセットの標的を分析できないことです。これは、標的シグナルのタンパク質に、免疫細胞に対する腫瘍細胞など、腫瘍の微小環境において異なる細胞の種類に対立する機能がある場合に重要となります。また、薬物による効果が両方のサブセットではなく片方に生じる場合は、さらに重要です。

Labcorp has developed a novel phospho-flow-based platform that simultaneously analyzes multiple cell signaling targets in both the host immune cell and the tumor cell compartments derived from solid tumors. これは、リン- タンパク質分析の前に、全造血細胞マーカー CD45 の免疫表現型検査で浸潤宿主免疫細胞から腫瘍細胞を識別することで実行できます。このプラットフォームの有用性を示すため、リン酸化 STAT5 と AKT (S6) の下方標的のレベルを、FLT3 阻害剤カボザンチニブで治療したマウスから取った皮下の MV-4-11 腫瘍で計測しました。図 1 は、カボザンチニブがヒトの (h)CD45+ 腫瘍細胞の pS6 と pSTAT5 の両方のレベルを下げることを示します。マウスの (m)CD45+ 宿主免疫細胞では、これらのリン化 - タンパク質のレベルに変化はありませんでした（図なし）。このため、PI3K/AKT と JAK-STAT のシグナル活性への洞察が得られます。これらは、非常に細かく記録された腫瘍成長と宿主免疫の両方を調節する経路で、治療介入にとって魅力的な標的です。

図 1： 固形腫瘍の STAT5 と MAPK シグナルのリン化フロー分析。

MV-4-11 は、急性骨髄性白血病（AML）のモデルで、いくつかの遺伝子のひとつにおける遺伝子変異によって悪性腫瘍を引き起こします。最もよくある事象は FLT3 遺伝子に生じます。これによって、PI3K/AKT と JAK-STAT シグナルの過剰な活性化をきっかけとする癌細胞を増殖する構造的に活性な FLT3 タンパク質が発生します。¹ カボザンチニブが介在する FLT3 阻害剤は、in vivo で MV-4-11 の腫瘍成長を阻むことが実証されており、in vitro の AKT と STAT シグナルの阻害と相互に関連付けられます。² 過剰に活性の高い PI3K/AKT と JAK-STAT5 シグナルは、多くのモデルで腫瘍成長を引き起こすことが詳細に記録されていますが、これらのシグナルタンパク質の活性は T 細胞の活性化と記憶 T 細胞の形成の生成も必要とします。^3、4、5この二分法は、固形腫瘍から抽出した免疫細胞と腫瘍細胞の両方のリン‐タンパク質を同時に分析できることの重要性を強く示します。

Tumor phospho-flow at Labcorp has potential to advance the cell signaling field.固形組織のリンフローは2010年に、肺腫瘍と腹膜腫瘍で説明しました。⁶ 以降、他の成功したアプローチの報告はほとんどありません。直近では、DISSECT と呼ばれる手法がサイトメトリーと併せて使われ、上皮サンプルのリン‐タンパク質の測定に成功し、続いて大腸腫瘍においても同じ測定が行われました。^7、8 注意すべき点として、これらの手法は組織採取後に固定が必要で、免疫表現型検査とシグナル分析の両方に使用される蛍光抗体に結合されるエピトープを改変できることが挙げられます。このことから、この手法により提出するデータの量が制限されることがあります。 Solid tumor phospho-flow at Labcorp does not require fixation, prior to immuno-staining.このため、分析用に別々の集団を標的にすることができます。当社では、サービス内容の拡大に努めております。継続的な取り組みでは、新しい固形腫瘍のリンフローサービスの開発に注力しています。このサービスでは、特定の T 細胞サブセットや腫瘍細胞に同時に効果を誘発する in vivo 治療の分析が可能になります。

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参照

²Lu, J. W.; Wang, A. N.; Liao, H. A.; Chen, C. Y.; Hou, H. A.; Hu, C. Y.; … & Lin, L. I. (2016). Cabozantinib is selectively cytotoxic in acute myeloid leukemia cells with FLT3-internal tandem duplication (FLT3-ITD). Cancer letters, 376(2), 218-225.

³Vara, J. Á. F.; Casado, E.; de Castro, J.; Cejas, P.; Belda-Iniesta, C.; & González-Barón, M. (2004). PI3K/Akt signalling pathway and cancer. Cancer treatment reviews, 30(2), 193-204.

⁴Rani, A. & Murphy, J. J. (2016). STAT5 in cancer and imCantrell, D. （2002年2月）

⁵Protein kinase B (Akt) regulation and function in T lymphocytes. In Seminars in immunology (Vol. 14, No. 1, pp. 19-26). Academic Press.

⁶Lin, C. C.; Huang, W. L.; Su, W. P.; Chen, H. H.; Lai, W. W.; Yan, J. J.; & Su, W. C. (2010). Single cell phospho‐specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho‐Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry Part A, 77(11), 1008-1019.

⁷Simmons, A. J.; Banerjee, A.; McKinley, E. T.; Scurrah, C. R.; Herring, C. A.; Gewin, L. S.; … & Irish, J. M. (2015). Cytometry‐based single‐cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF‐α‐induced apoptosis in vivo. Molecular systems biology, 11(10), 835.