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新しい CompDC™ パネルを使用したフローサイトメトリーによる包括的な樹状細胞解析

著者:David Draper 博士 | 科学開発部門アソシエイトディレクター
Date: February 2019


To address the growing need for robust comprehensive DC immunophenotyping in murine pre-clinical models, we have configured a new standard panel, CompDC™. この Tech Spotlight では、このパネルを用いて、腫瘍内の複数の DC サブセットおよびその他の組織由来細胞サンプルを分析する方法を紹介します。

T細胞媒介の抗腫瘍反応は、抗原提示細胞(APC)の活動に応じて腫瘍特異抗原(TAA)を作り出し、共刺激信号をT細胞に提供します。すると今度は腫瘍固有のT細胞を活性化し、その拡大と効果を発揮する腫瘍のリクルートを引き起こします。樹状細胞(以下DC)は、この過程に役立つプロフェッショナル抗原提示細胞(以下APC)です。DCは多数の共刺激リガンドを発現するために活性化され、抗原を内在化して免疫優勢ペプチドをCD4+とCD8+ 両方のT細胞に提供することができます。DC機能を引き出す新たな治療の開発は精力的に調査がなされている分野です。 To facilitate these efforts and address the growing need for robust comprehensive DC immunophenotyping in murine pre-clinical models, we have configured a new standard panel, CompDC™.この Tech Spotlight では、このパネルを用いて、腫瘍内の複数の DC サブセットおよびその他の組織由来細胞サンプルを分析する方法を紹介します。

For a general introduction to the different DC subsets and their function in cancer biology, read our blog “An Introduction to Dendritic Cell Biology and Analysis Using Syngeneic Immuno-Oncology Models” 

CompDC™ パネルは、in vivo療法が、腫瘍内の異なるDCサブセットにおける多量な存在や活動状態、腫瘍排出リンパ節(LN)、その他のホストコンパートメントに影響を及ぼすかどうかを治験責任医師が判断することを可能にします。このパネルは12-色パネルで、一連の抗体を組み合わせることによって、正しく観察されたときに独特のDZサブセットを描き出し、DCのT細胞活性ポテンシャルに関する洞察を提供します(図表1)。細心のゲート戦略により、このパネルはまず、除外ゲートを使って、マクロファージ、顆粒球、B細胞を取り除く事によって精確なDC解析を促進します この過程はDC解析が、無関係な、あるいは自家蛍光の細胞によって汚染される危険を最小にします。次にCD24発現が使用され、従来型の(一般に中程度から高程度のCD11c およびMHC クラスⅡレベルにより分類される)DCサブセットの描出を助けます。これらの伝統的なDCにはCD103+/CD8+ DC1 サブネット、そしてCD8+ と CD4+ のT細胞抗腫瘍反応を促すことが証明されているCD11b+DC2 サブネットを含んでいます(図表 1A)。[1] XCR1発現は、DC媒介の CD8+ T細胞の活性化に必要な表現型である交差提示によってDCのマーカーとなっていることが複数のグループによって記録されています。[2]図表1Bおよび1Cでは、B16-F10 腫瘍派生細胞と排出リンパ節内のXCR1+DC解析を証明しています。ご覧のように、XCR1発現は一般にDC1サブセットと関連付けられています。最後に、成熟マーカーCD80とCD86の発現はDCのT細胞共刺激ポテンシャルを評価する為に計測されます。図表1Dではこれらのマーカーの発現はB16-F10悪性黒色腫瘍内のDCにおいては比較的低く、腫瘍の微小環境によってDCに付与された免疫抑制を示唆しています。

テーブル1:CompDC™ パネル抗体と有用性の説明

抗体/色素 説明  
CD45 汎免疫細胞マーカー  

F4/80, Ly-6G, CD19

マクロファージ、顆粒球、およびB細胞のための除外ゲート  
CD11c 樹状細胞マーカー  
CD24 樹状細胞マーカー  
CD8 DC1 マーカー  
MHCクラスⅡ 樹状細胞マーカー/成熟マーカー  
CD103 DC1 マーカー  
CD11b DC2 マーカー  
XCR1 交差提示/転移性樹状細胞マーカー  
CD80 成熟マーカー  
CD86 成熟マーカー  
死細胞検出試薬 死細胞の除外  
The CompDC™ は それぞれLy-6C/CD206とSiglec-H抗体内で代用することによって、炎症性DC(InfDC)と形質球様DCサブセットを解析するカスタマイズが可能です。  
図表1:CompDC™パネルを使用したDCサブセットの解析 マウスから B16-F10 黒色腫瘍を採取。腫瘍派生細胞(A)、CD103内のXCR1発現+腫瘍(B)内のDC1細胞、およびB16-F10腫瘍を持つマウス(C)リンパ節 (LN)におけるDC1とDC2サブセット解析 腫瘍派生のDC(D) 全体における共刺激マーカーCD80およびCD86の発現 赤線の頂点は標的染色細胞を表しています。青線の頂点は非染色陰性対照を表しています。

図表1:CompDC™パネルを使用したDCサブセットの解析 マウスから B16-F10 黒色腫瘍を採取。腫瘍派生細胞(A)、CD103内のXCR1発現+腫瘍(B)内のDC1細胞、およびB16-F10腫瘍を持つマウス(C)リンパ節 (LN)におけるDC1とDC2サブセット解析 腫瘍派生のDC(D) 全体における共刺激マーカーCD80およびCD86の発現 赤線の頂点は標的染色細胞を表しています。青線の頂点は非染色陰性対照を表しています。
 

CompDC™は2つの追加DCサブセットを解析するために、カスタマイズが可能です。それには抗CD206と抗Ly-6C抗体内で代用を行うことで実行される炎症性DC(infDC)が含まれます。InfDCは抗腫瘍活動を促進することを示しており、単球性の骨髄系由来サプレッサー細胞(M-MDSC)ゲートを CD11c+MHCII+CD11b+CD206+ 細胞と描出することができます(図表2A)。[3]形質球様DC(pDC)は抗Siglec-H抗体内で代用することで定量化が可能です。TMEのpDC機能は未だ完全に特性化されていませんが、多くのレポートがこれらのpDCには機能障害が存在し得ること、また抗腫瘍反応においては免疫抑制的影響が出る可能性を示しています。[4]pDCは一般に低レベルのCD11c発現を持ち、また図表2Bに示されているようにSiglec-Hはポジティブです。

図表2:infDC および pDCサブセットの解析は、 CompDC™パネルをカスタマイズすることで可能になります。(A) B16-F10腫瘍派生細胞内における infDCの解析 (B) CT26結腸直腸癌派生細胞内における pDC の解析

図表2:infDC および pDCサブセットの解析は、 CompDC™パネルをカスタマイズすることで可能になります。(A) B16-F10腫瘍派生細胞内における infDCの解析 (B) CT26結腸直腸癌派生細胞内における pDC の解析

To learn more about the CompDC™ panel and how to incorporate it into your research, contact the scientists at Labcorp.


参照


1Gardner, A., & Ruffell, B. (2016). Dendritic cells and cancer immunity. Trends in immunology, 37(12), 855-865.

2Wylie, B., Seppanen, E., Xiao, K., Zemek, R., Zanker, D., Prato, S., … & Waithman, J. (2015). Cross-presentation of cutaneous melanoma antigen by migratory XCR1+ CD103− and XCR1+ CD103+ dendritic cells. Oncoimmunology4(8), e1019198.

3Kuhn, S., Yang, J., & Ronchese, F. (2015). Monocyte-derived dendritic cells are essential for CD8+ T cell activation and antitumor responses after local immunotherapy. Frontiers in immunology6, 584. 

4Mitchell, D., Chintala, S., & Dey, M. (2018). Plasmacytoid dendritic cell in immunity and cancer. Journal of neuroimmunology.

注:すべての動物管理および使用は、AAALAC 認定を取得した施設にて IACUC 手順の審査および承認を経て動物倫理規制に従い行われました。

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