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フローサイトメトリーによる絶対計数 - 免疫表現型データ解釈の精度を最大化する

著者:David Draper 博士 | 科学開発部門アソシエイトディレクター
Date: July 2018


この Tech Spotlight では、絶対計数の原理と、腫瘍の免疫表現型解析と組み合わせて使用した場合にこのサービスが提供する利点を紹介します。

絶対計数は、フローサイトメトリーサイエンティストが組織内の細胞の総数を定量化できるアプリケーションであり、免疫細胞による腫瘍浸潤の測定値として使用できます。この Tech Spotlight では、絶対計数の原理と、腫瘍の免疫表現型解析と組み合わせて使用した場合にこのサービスが提供する利点を紹介します。

腫瘍微小環境(TME)内の免疫応答における動的変化を正確に測定する能力は、新しい免疫調節療法の試験を行う際に極めて重要となります。サブセットを正確に描写するには、ロバストな免疫表現型検査パネルの構成が必要ですが、これらのエンドポイントが報告される方法は、データの最終的な解釈の仕方に影響を与える可能性があります。一般的な測定値は「CD45+ 細胞のパーセント」で、各サブセットの相対分布を総免疫細胞のパーセントとして測定します。1,2 この方法は、異なる腫瘍促進作用と抗腫瘍作用を持つサブセットの割合に対する治療の効果を定量化するのに役立つため、価値があります。たとえば、CD8+ T 細胞の割合が増加し、それに対応して制御性 T 細胞が減少することは、治療により TME における制御性 T 細胞媒介免疫抑制が低下したことを示します。

ただし、分布測定を唯一の読み出しとして使用することには限界があります。これは、以下の例で示されます。 この研究では、CT26 担癌マウスを抗 mCTLA-4 チェックポイント阻害剤で治療し、その結果として腫瘍増殖が著しく阻害されました(図 1)。 作用機序を調査するため、まずフローサイトメトリーを使用して腫瘍由来の CD3+ 細胞と CD11b+ 細胞(それぞれ T 細胞と骨髄系細胞)の CD45+ 細胞全体中の分布をプロファイルしました(図 2 を参照)。このデータを解釈した場合、CTLA-4 遮断が T 細胞数の増加と同時に骨髄細胞の減少の両方を引き起こしたと結論付けられる可能性があります。これは、治療の機序作用が、抗腫瘍 CD8+ T細胞数の増加、ならびに免疫抑制性骨髄細胞の縮減によって媒介されることを示唆します。以下に示すように、この結論は正しくありません。

図 1:CT26 細胞を Balb/c マウスの右腋窩に皮下移植した。腫瘍が確立されたときに、n=10 動物/群の投与を開始し、腫瘍の進行をノギス測定によって監視した。14 日目のサンプリングの前に、抗体用量を週 2 回投与した。

図 1:CT26 細胞を Balb/c マウスの右腋窩に皮下移植した。腫瘍が確立されたときに、n=10 動物/群の投与を開始し、腫瘍の進行をノギス測定によって監視した。14 日目のサンプリングの前に、抗体用量を週 2 回投与した。

絶対計数のタンデム計算は、上記の限界を克服するためによく使用されます。このエンドポイントは、免疫サブセットによる腫瘍の浸潤を正確に測定し、通常は単位質量あたりの総細胞数として報告されます。3,4,5 上記の研究に絶対計数を加えると、実際の総骨髄細胞数/腫瘍グラムは、抗 mCTLA-4 治療後も変化しませんでした(図 2)。むしろ、骨髄細胞の割合に観察された減少は、絶対 T 細胞数に示された増加によって引き起こされた可能性が高いと考えられます。ここで重要な点は、標的サブセットの分布における変化が治療によって引き起こされたとき、それは必ずしもその細胞サブセットの絶対数の変化が原因ではなく、むしろ異なるサブセットの拡大または縮減の結果として発生する可能性があるということです。

図 2:CT26 腫瘍における T 細胞と骨髄細胞の分布と絶対計数測定の比較。 Statistical analysis was performed using a Student’s t-test (*p<0.05).

図 2:CT26 腫瘍における T 細胞と骨髄細胞の分布と絶対計数測定の比較。 Statistical analysis was performed using a Student's t-test (*p<0.05).

腫瘍関連マクロファージ(TAM)および T 細胞サブセットの後続の免疫表現型解析では、絶対計数のエンドポイントを含めることの価値がさらに強調されます。図 3 に示すように、腫瘍の M2 TAM の割合が減少することが解析により明らかになりましたが、絶対数は変化しませんでした。 したがって、最初の解析とは対照的に、絶対カウントは M2 TAM 薬力学がこの研究の全体的な有効性に寄与することを示していません。そして、これは利用可能なデータに基づいた、より信頼できる結論です。最後に、抗 mCTLA-4 療法は、CD8+ T 細胞と CD4+ ヘルパー T 細胞の両方の絶対数に増加を引き起こしました。これらをまとめると、こうしたデータは、組織由来のサブセットの総細胞数を正確に定量化するために絶対計数がいかに不可欠であるかを示しています。

図 3:CT26 腫瘍におけるM1 およびM2 TAM、CD8+ T 細胞、CD4+ ヘルパー細胞の分布と絶対計数測定の比較。  Statistical analysis was performed using a Student’s t-test (*p<0.05).

図 3:CT26 腫瘍におけるM1 およびM2 TAM、CD8+ T 細胞、CD4+ ヘルパー細胞の分布と絶対計数測定の比較。 Statistical analysis was performed using a Student's t-test (*p<0.05).

絶対計数の方法論

腫瘍関連マクロファージ(TAM)および T 細胞サブセットの後続の免疫表現型解析では、絶対計数のエンドポイントを含めることの価値がさらに強調されます。図 3 に示すように、腫瘍の M2 TAM の割合が減少することが解析により明らかになりましたが、絶対数は変化しませんでした。 したがって、最初の解析とは対照的に、絶対カウントは M2 TAM 薬力学がこの研究の全体的な有効性に寄与することを示していません。そして、これは利用可能なデータに基づいた、より信頼できる結論です。最後に、抗 mCTLA-4 療法は、CD8+ T 細胞と CD4+ ヘルパー T 細胞の両方の絶対数に増加を引き起こしました。これらをまとめると、こうしたデータは、組織由来のサブセットの総細胞数を正確に定量化するために絶対計数がいかに不可欠であるかを示しています。

Fig. 4: Gating strategy to measure the volume of sample aspirated, absolute counts of total live cells, and live CD45+ cells, using the Labcorp absolute counting flow panel.

Fig. 4: Gating strategy to measure the volume of sample aspirated, absolute counts of total live cells, and live CD45+ cells, using the absolute counting flow panel.

図 4 は、絶対細胞数の計算方法を示します。 ビーズ領域は、吸引サンプル量の測定を可能にするために、フローサイトメーターによって取得されたビーズの数を定量化します。 細胞ゲートは、死細胞を除外する生存性色素を使用して分析されます。死細胞を除外した後、CD45 発現を測定し、ライブ CD45+ 細胞ゲートに入る細胞のパーセントを計算します。次に、サイトメーターによって検出された CD45+ 免疫細胞の総数を以下の式を使用して計算します。最後に、開始時の腫瘍の質量が分かっているので、細胞数/腫瘍のグラムを逆算できます。

The total number of CD45+ immune cells detected by the cytometer is then calculated using the formula below.最後に、開始時の腫瘍の質量が分かっているので、細胞数/腫瘍のグラムを逆算できます。

上記の研究の全データセットは、リクエストにより入手できます。CT26 腫瘍の以下のサブセットのカウントとプロファイルに対するチェックポイント遮断効果と、これらの測定に使用されたフローパネルについて説明しています。

  • 顆粒球の骨髄由来抑制細胞

  • 単球性骨髄由来抑制細胞

  • 樹状細胞

  • 腫瘍関連マクロファージ細胞(M1 および M2)

  • B 細胞

  • ナチュラルキラー細胞

  • ナチュラルキラー T 細胞

  • CD8+ T 細胞

  • CD4+ ヘルパー T 細胞

  • 制御性 T 細胞

Contact the scientists at Labcorp to request the full data set or to learn more about our absolute counting service and how it can be applied to your preclinical research.


参照


1Kadić, Elma 他 「Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determined by multiparametric single cell mass cytometry analysis」(マルチパラメトリック単一細胞質量サイトメトリー分析により決定される腫瘍標本の免疫細胞亜集団の描出における凍結保存の影響) BMC immunology 18.1 (2017): 6。

2Lewis, Katherine E. 他 「Interleukin-21 combined with PD-1 or CTLA-4 blockade enhances antitumor immunity in mouse tumor models」 Oncoimmunology 7.1 (2018): e1377873。

3Muroyama, Yuki 他 「Stereotactic radiotherapy increases functionally suppressive regulatory T cells in the tumor microenvironment」(定位放射線療法による腫瘍微小環境での機能抑制的な制御性 T 細胞の増加) Cancer immunology research 5.11 (2017): 992。

4Balza, Enrica 他 「The therapeutic T‐cell response induced by tumor delivery of TNF and melphalan is dependent on early triggering of natural killer and dendritic cells」(TNF とメルファランの腫瘍送達によって誘発される治療的 T 細胞応答におけるナチュラルキラー細胞と樹状細胞の早期トリガーへの依存) European journal of immunology 47.4 (2017): 743-753。

5Buisseret, Laurence 他 「Tumor-infiltrating lymphocyte composition, organization and PD-1/PD-L1 expression are linked in breast cancer」 Oncoimmunology 6.1 (2017): e1257452。
 
注:すべての動物管理および使用は、AAALAC 認定を取得した施設にて IACUC 手順の審査および承認を経て動物倫理規制に従い行われました。

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